Prosedur Penelitian Double Haploid Menggunakan Aplikasi Kolkisin
Teknologi double haploid menjadi bagian yang tidak terpisahkan dari banyak program pemuliaan jagung komersial karena galur double haploid menawarkan beberapa keuntungan ekonomi, logistik dan genetik dibandingkan galur bawaan konvensional. Dalam dua sampai tiga dekade terakhir, teknologi double haploid telah muncul sebagai alternatif yang efisien untuk metode tradisional pengembangan galur bawaan. Teknologi ini pada dasarnya mengambil sampel gamet pemisah dari plasma nutfah sumber, biasanya persilangan biparental atau populasi, dan menghasilkan galur homozigot sepenuhnya dalam satu langkah. Metode in vitro dan in vivo dapat digunakan untuk mengembangkan galur double haploid jagung. Namun, metode in vivo telah terbukti lebih andal dan efisien dalam produksi galur double haploid skala besar dan karena itu umumnya digunakan dalam jagung (Chaikam et.al 2019).
Keuntungan teknologi double haploid adalah untuk menghasilkan galur yang tercepat dan paling efisien, serta yang benar-benar homozigot untuk program pemuliaan jagung. Hal ini memungkinkan pengembangan galur inbred homozigot dalam satu tahun, dibandingkan dengan tiga hingga 4 tahun inbreeding dengan metode selfing berulang konvensional, saat menggunakan pembibitan di luar musim (Röber et al.2005). Penggunaan galur double haploid menawarkan peluang untuk meningkatkan perolehan seleksi. Homozigositas yang lengkap dari galur double haploid memungkinkan fenotipe yang lebih akurat di beberapa lokasi dibandingkan dengan famili pada selfing generasi awal (Foiada et al. 2015; Yan et al. 2017). Penggunaan galur double haploid dalam kombinasi dengan penanda molekuler menawarkan.
Yan G, Liu H, Wang H et al (2017) Accelerated generation of selfed pure line plants for gene identification and crop breeding. Front. Plant Sci 8:1786peluang lebih lanjut untuk meningkatkan perolehan seleksi. Rasio pemisahan 1: 1 untuk penanda dominan dan kodominan membuat galur double haploid ideal untuk aplikasi penanda (Yan et al. 2017). Metode double haploid dalam kombinasi dengan pemilihan bantuan penanda (MAS) memungkinkan fiksasi alel yang disukai lebih cepat dan lebih efisien. Dengan demikian, menggabungkan penanda molekuler dan teknologi double haploid adalah alat yang sangat ampuh untuk fiksasi gen target dan penumpukan gen (Melchinger et al. 2011) karena frekuensi genotipe homozigot yang diinginkan menurun pada tingkat yang lebih rendah pada galur double haploid daripada pada genotipe backcross.
Produksi galur jagung double haploid melibatkan empat langkah berikut: (1) induksi haploid; (2) identifikasi haploid pada tahap benih atau semai; (3) penggandaan kromosom pada benih haploid; dan (4) selfing tanaman double haploid yang subur untuk menghasilkan benih galur double haploid. Penggandaan kromosom buatan dicapai dengan cara memberikan perlakuan benih haploid menggunakan bahan kimia yang menunjukkan aktivitas anti-mitosis. Kolkisin banyak digunakan untuk penggandaan kromosom dalam jalur produksi double haploid (Chaikam dan Mahuku 2012; Melchinger et al. 2016b). Protokol standar perendaman bibit yang memiliki koleoptil sepanjang 2 cm dalam larutan kolkisin (0,04-0,06%) dengan 0,5% Dimethyl Sulfoxide (DMSO) selama 8-12 jam (Chaikam and Mahuku 2012; Prigge and Melchinger 2012).
Pada kegiatan penelitian uji coba jagung double haploid menggunakan aplikasi kolkisin, terdapat beberapa tahap yang dilakukan, antara lain :
1. Perkecambahan benih jagung inducer haploid
2. Perlakuan kolkisin
3. Aklimatisasi
Dalam protokol ini, biji haploid berkecambah di atas kertas buram selama 1-3 hari sampai koleoptil berukuran sekitar 2 cm. Kemudian ujung koleoptil dipotong sebelum terendam dalam larutan perlakuan kolkisin dengan taraf konsentrasi 0,02%, 0,04%, 0,06% dan 0,08% yang telah ditambahkan dengan larutan DMSO 0,5% . Perendaman dilakukan dengan cara diletakkan di alat shaker dengan kecepatan 50 rpm selama 12 jam. Selanjutnya, bibit dicuci di bawah air mengalir selama kurang lebih 20 menit, kemudian ditanam di media sekam dan pupuk pada pot biodegradable di rumah kaca untuk pemulihan sampai 10–15 hari tergantung pada pertumbuhan. Selanjutnya dipindahkan ke kebun pembibitan.
Perkecambahan Benih Haploid (Lesty, 2021)
Pemberian Perlakuan Larutan Kolkisin (Lesty,2021)
Perendaman Benih Selama 12 jam (Lesty, 2021)
Aklimatisasi (Lesty, 2021)
DAFTAR PUSTAKA
Chaikam V, Mahuku G (2012) Chromosome doubling of maternal haploids. In: B.M. Prasanna, Chaikam V, Mahuku G (eds) Doubled haploid technology in maize breeding: theory and practice. CIMMYT, Mexico, DF, pp 24–29
Chaikam V, Molenaar W, Melchinger AE, Boddupalli PM (2019) Doubled haploid technology for line development in maize: technical advances and prospects. Theor and Appl Genet 132:3227–3243
Foiada F, Westermeier P, Kessel B et al (2015) Improving resistance to the European corn borer: a comprehensive study in elite maize using QTL mapping and genome-wide prediction. Theor Appl Genet 128:875–891
Melchinger AE, Technow F, Dhillon BS (2011) Gene stacking strategies with doubled haploids derived from biparental crosses: theory and simulations assuming a finite number of loci. Theor Appl Genet 123:1269–1279
Melchinger AE, Brauner PC, Böhm J, Schipprack W (2016b) In vivo haploid induction in maize: comparison of different testing regimes for measuring haploid induction rates. Crop Sci 56:1127–1135
Prasanna BM (2012) Doubled haploid technology in maize breeding:an overview. In: Prasanna BM, Chaikam V, Mahuku G (eds) Doubled haploid technology in maize breeding: theory and practice. CIMMYT, Mexico, DF, pp 1–8
Prigge V, Melchinger AE (2012) Production of haploids and doubled haploids in maize. In: Loyola-Vargas VM, Ochoa-Alejo N (eds) Plant cell culture protocols. Springer, Berlin, pp 161–172
Röber FK, Gordillo GA, Geiger HH (2005) In vivo haploid induction in maize-performance of new inducers and significance of doubled haploid lines in hybrid breeding. Maydica 50:275
Yan G, Liu H, Wang H et al (2017) Accelerated generation of selfed pure line plants for gene identification and crop breeding. Front. Plant Sci 8:1786
